蛋白质实验（G-actin 聚集到 F-actin）
参考：
- Pardee J.D., and Spudich, J.A. 1982. Methods in Cell Biol. 24:271-288.
- https://www.cytoskeleton.com/pdf-storage/datasheets/bsa01.pdf
- https://www.cytoskeleton.com/pdf-storage/datasheets/bsa02.pdf
- https://www.cytoskeleton.com/pdf-storage/datasheets/akl99.pdf
- https://www.jove.com/t/55613/measuring-protein-binding-to-f-actin-by-co-sedimentation?language=Chinese
Biochemistry 通过共沉淀测量蛋白与F-肌动蛋白的结合 Published: May 18, 2017 doi: 10.3791/55613
宗旨：
- 实验操作全流程干燥低温，避免反复冷冻解冻；离心管用不到了就放冰袋上，减少用手接触次数；
- 密封保存是指密封膜+双层密封袋+有色硅胶
- ATP，DTT粉末密封保存在-20度，半年一换（未开封可存放两年）；含有ATP的溶液2小时一换；
- 蛋白质样品密封保存在-70度，三个月一换
- G-Buffer溶液理论上可在-20摄氏度密封保存1年，P-Buffer溶液理论上可以在-70摄氏度密封保存1年，每次使用时再加入ATP，DTT便可使用；但是建议每次实验重新配置，不要用上一次剩余的溶液
x.1 制备 General Actin Buffer(G-Buffer)
General Actin Buffer 的参考链接如下：https://www.cytoskeleton.com/pdf-storage/datasheets/bsa01.pdf
理论配置条件：100ml of sterile de-ionized water to give a 1X strength buffer; 0.2 mM calcium chloride, 5 mM Tris-HCl ; 0.2 mM ATP; pH 8.0
实际配置条件：0.2mM/L 氯化钙 + 5mM/L Tris-HCl + 0.2 mM/L ATP + 0.5mM/L DTT，pH 8.0 ，具体见下表
| 序号 | 药品 | CaCl2·2H2O | Tris-HCl | Tris | ATP (后加) | 0.5 mM/L DTT (后加) | D2O |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| - | 摩尔质量(g/mol) | 147.01 | 157.6 | 121.14 | 605.24 | 238.3 | 20.03 |
| 1 | 1X 体积或质量(ml/g) | 0.00014701 | 0.005925 | 0.00151425 | 0.00060524 | 0.00059575 | 5 |
| 2 | 500X 体积或质量(ml或者g) | 0.0014701 | 0.05925 | 0.0151425 | - | - | 0.1 |
| 3 | 10X 体积或质量(ml或者g) | 0.00014701 | 0.005925 | 0.00151425 | 0.00060524 | 0.00059575 | 0.5 |
| 4 | 10X 体积或质量(ml或者g) | 0.0014701 | 0.05925 | 0.0151425 | 0.0060524 | 0.0059575 | 5 |
说明：
- General Actin Buffer，简称G-Buffer溶液，用于体外缓冲单体肌动蛋白，是处理生物活性肌动蛋白的缓冲液。
- G-Buffer在配置过程中，是不加入ATP的，因为ATP时间长了会水解，我们在每次使用G-buffer时，会添加0.2mM/L的ATP。对于存放时间过长的G-buffer缓冲液应补充0.2 mM ATP用以创建最佳的肌动蛋白单体缓冲液。
- G-Buffer在配置完成后，能够在4摄氏度干燥环境下（<10%，可以通过双层密封膜+硅胶实现）放置一年，但是考虑到ATP的存放温度是-20度，适合pH值是7.5左右，所以我们最终会放置在-20度的冰箱中并标注制备样品的日期，存放有效时间是1年。
- G-Buffer中的钙离子和ATP对于肌动蛋白的构象很重要，ATP在肌动蛋白聚合期间水解，并在聚合过程中是必需的。
- 注意，含有ATP的溶液应该在解冻后1-2小时内使用，并避免多次冷冻和解冻；ATP和DTT固体在打开后有效存放时间是6个月到2年。
- 氯化钙研磨之后会吸水。
步骤：
Method1:
- 配置 5mL 的 10X G-Buffer + ATP + DTT 溶液（即序号4），当天需要使用时就按照1:10的配比混合 D2O
- 将多余的溶液放置于-20度保存；如果以后（一周内）需要使用，则取出需要的溶液，按照ATP，DTT的配比加入适量的ATP，DTT
Method 2:（由于氘水吸水，转移次数过多，已经废置）
- 配置0.1mL的500X G-Buffer溶液（序号2）
- 配置0.5mL的10X ATP DTT溶液（序号3）
- 取出1mL的D2O，从中加入0.002mL的500X溶液，加入0.1mL的10X ATP DTT溶液，配出了1mL的1X溶液
x.2 制备 Actin Polymerization Buffer(P-Buffer)
Actin Polymerization Buffer 的参考链接如下：https://www.cytoskeleton.com/pdf-storage/datasheets/bsa02.pdf
理论配置条件：10X溶液::100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50mM guanidine carbonate pH 7.5
实际配置条件：10X溶液::10X::100 mM Tris HCl + 20 mM MgCl2 + 500 mM KCl + 10 mM ATP, pH 7.5, 具体见下表
| 序号 | 药品 | Tris-HCl | Tris | MgCl2·6H2O | KCl | ATP (后加) | D2O |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| - | 摩尔质量(g/mol) | 157.6 | 121.14 | 203.3 | 74.55 | 605.24 | 20.03 |
| 1 | 10X 体积或质量(ml或者g) | 0.030338 | 0.0021199 | 0.008132 | 0.07455 | 0.0121048 | 2 |
说明：
- Actin Polymerization Buffer，以下简称P-Buffer溶液（实际上是粉末，但是我们配置成了溶液），值得注意的是，我们配置的溶液初始浓度是10X浓度，需要稀释后将该缓冲液以1倍最终浓度用作体外单体肌动蛋白聚合的缓冲液，适用于多种物种。
- 粉末可以在4摄氏度下保存1年，溶液在-70度以下保存，注意ATP粉末只可以保存6个月-2年（合理估计在打开后，在最差保存条件下，即未封口+未硅胶只能保存6个月）。实际情况我们需要将配置好的溶液在-70摄氏度放置1年，并标注制作时间（如果条件不允许只能存放在-20摄氏度）。
- 注意，含有ATP的溶液应该在解冻后1-2小时内使用，并避免多次冷冻和解冻；ATP和DTT固体在打开后有效存放时间是6个月到2年。
步骤：
- 配置2mL的10X溶液（序号1）。
- 将多余的溶液放置于-70度保存；如果以后（一周内）需要使用，则取出需要的溶液，按照ATP，DTT的配比加入适量的ATP，DTT
x.3 pH计
测量G-Buffer和P-Buffer pH值分别为8.0和7.5
x.4 制备 F-actin 蛋白质
兔肌动蛋白参考链接如下：https://www.cytoskeleton.com/pdf-storage/datasheets/akl99.pdf
说明：
- 肌动蛋白冻干粉末在4°C下低于10%湿度的干燥条件下储存时，稳定期为6个月（考虑到运输时间，实际上保存时间为3个月）；浓缩后分装的10mg/mL蛋白质在-70摄氏度下稳定期为6个月（可以在氘水中溶解，也可以在G-Buffer中溶解后分装，实际操作时是用氘水溶解）；在4摄氏度下可以保持数周的活性；
- 在没有ATP、双价阳离子和二硫苯酚（DTT）的情况下，单体肌动蛋白是不稳定的；单体肌动蛋白在pH低于6.5或高于8.5的条件下是不稳定的。
- 单体肌动蛋白将在>2毫摩尔钾离子（K+）、钠离子（Na+）以及>0.05毫摩尔镁离子（Mg2+）下聚合。
- 避免反复冷冻解冻。
步骤：
- 制备10X G-Buffer + ATP + DTT 溶液和10X P-Buffer + ATP 溶液，分别标记为
10X G和10X P。 - 使用0.1mL氘水溶解干冻蛋白，得到浓缩的10mg/mL蛋白质溶液，标记为
A，可以分装成不同小管做不同实验。 - 取出0.1mL 10X G-Buffer + ATP + DTT 溶液，与0.9mL氘水混合，制备了1mL 1X G-Buffer + ATP + DTT 溶液，标记为
1X G。 - 取出0.03mL浓缩的10mg/mL蛋白质溶液，加入0.720mL的 1X G-Buffer + ATP + DTT 溶液（尽量取用底部的溶液），得到0.75mL的 0.4mg/mL的蛋白质溶液，标记为
B，从中取出0.65mL的蛋白质溶液用于培养F-actin，标记为C，剩余的用于培养G-actin（即将肌动蛋白重溶至0.4毫克/毫升，使用0.2毫摩尔三磷酸腺苷（ATP）和0.5毫摩尔二硫苯酚（DTT）进行补充的一般肌动蛋白缓冲液中）。 - 在冰上孵育60分钟，以去除存储过程中产生的聚合物质。
- 在4°C的微型离心机中以14,000转每分钟（rpm）离心15分钟。
- 将蛋白质转移到新的微型离心管中（在这一步中你可以选择使用Precision Red蛋白质测定试剂确定总蛋白质浓度）。
- 将肌动蛋白溶液取出200微升，分装到三个超速离心管中，标记为
D，E，F。 - 向每个离心管中加入20微升（1/10的体积）聚合缓冲液，并充分混合。
- 在室温下孵育1小时。
- 以100,000 x g离心1小时，沉淀聚合的肌动蛋白。
- 从每个管中去除上部90%的上清液，转移到干净的微型离心管中，标记为
D'，E'，F'。90%上清液是未聚合的G-actin，10%的底部溶液是聚合的F-actin。
x.5 制备 F-actin 蛋白质（刘畅版本）
x.6 实际实验步骤(2023.12.18更新)
在实际测量FTIR时候，使用的是50um厚度的垫圈和1.2uL的溶液。
需要500uL + 100uL + 200uL + 100uL + 108uL + （选做70uL） 氘水，
- 使用1.5mL去菌离心管配置101uL 1x G-Buffer，在试管上标注
1x-G，
| 序号 | 药品 | CaCl2·2H2O | Tris-HCl | Tris | ATP (后加) | 0.5 mM/L DTT (后加) | D2O |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| - | 摩尔质量(g/mol) | 147.01 | 157.6 | 121.14 | 605.24 | 238.3 | 20.03 |
| 5 | 100X 体积或质量(ml或者g) | 0.0014701 | 0.05925 | 0.0151425 | 0.0060524 | 0.0059575 | 0.5 |
| 6 | 1X 体积或质量(ml或者g) | 取 1uL 100x 和 100uL D2O 合并 |
使用1.5mL去菌离心管配置G-Buffer溶液，在试管上标注100x-G，10x-G，1x-G，最终得到101uL 1x G。
- 使用1.5mL去菌离心管配置110uL 10x P-Buffer，在试管上标注
10x-P，
| 序号 | 药品 | Tris-HCl | Tris | MgCl2·6H2O | KCl | ATP (后加) | D2O |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| - | 摩尔质量(g/mol) | 157.6 | 121.14 | 203.3 | 74.55 | 605.24 | 20.03 |
| 2 | 100X 体积或质量(ml或者g) | 0.030338 | 0.0021199 | 0.008132 | 0.07455 | 0.0121048 | 0.2 |
| 3 | 10X 体积或质量(ml或者g) | 取 10uL 100x 和 100uL D2O 合并 |
使用1.5mL去菌离心管配置G-Buffer溶液，在试管上标注100x-P，10x-P，最终得到110uL 10x P。
-
测定pH值，
1x-G的pH应该为8.0，10x-P的pH应该为7.5。 -
（选做）从10x-G得到1x-G。取出10(+2=12)uL的
10x-G溶液，装入1.5mL离心管中（因为实验室的离心机只能放1.5mL离心管），将其和90(+18=108)uL的D2O溶解，得到100(+20=120)uL的1x-G溶液并标记为1x-G。
1x-G的pH应该为8.0。
-
取出装有1mg肌动蛋白G-actin的试管（-20摄氏度存储，为固体粉末状），将蛋白转移至1.5mL离心管中，使用100uL的
1x-G溶液将蛋白质全部溶解后得到10mg/mL的蛋白质溶液，将离心管标记为A。 -
在冰上孵育60分钟，以去除存储过程中产生的聚合物质。
-
将蛋白质在4摄氏度，14krpm，离心15min（双试管对称离心）。如果有沉淀，则只取出上清液（大概溶液总体积的90%），转移到1.5mL离心管中，并标记为
B；如果无沉淀，则继续保留原试管A。 -
（选做）为能得到在FTIR下正确浓度，我们从
A/B中取出10uL放入1.5mL离心管中，标记为C，目的是：稀释出不同浓度并测定FTIR来观察在红外下能清晰看到信号的蛋白质浓度。
我们先从总氘水中转移出70uL氘水进1.5mL离心管中，标记为D。每次从B管取出2uL蛋白和特定剂量的C混合，所配比的浓度列表如下，
| Number | Sample | D2O或者G-Buffer | Actual solution concentration |
|---|---|---|---|
| 1 | 2uL G-actin | 0uL | 10mg/mL G-actin |
| 2 | 2uL G-actin | 2uL | 5mg/mL G-actin |
| 3 | 2uL G-actin | 8uL | 2mg/mL G-actin |
| 4 | 2uL G-actin | 18uL | 1mg/mL G-actin |
| 5 | 2uL G-actin | 38uL | 0.5mg/mL G-actin |
- 接下来，将G-actin变为F-actin。
从（A或者B）中取出30uL溶液放入1.5mL离心管中，标记为E，加入3uL的10x-P溶液，放在室温下（25摄氏度）孵化1h。
将E25摄氏度14krpm或者（100,000g）离心1h。如果有沉淀，则只取出上清液（大概溶液总体积的90%），转移到1.5mL离心管中，并标记为F；如果无沉淀，则继续保留原试管E。
- 最终的G-actin在
A/B中，F-actin在E/F中。