紫外可见分光光度计 | 探索光的工具 | 详解
探索光的工具 : 紫外可见分光光度计之用途
紫外-可见光谱法（UV-Vis）是一种简单而有效的实验室分析方法，用于确定大分子化合物或其他物质的浓度。这项技术需要使用分光光度计来测量样品吸收的光量，并记录化合物通过的特定波长，从而产生不同的光谱图谱。
分光光度计向装有所需物质的比色皿（一种半透明容器）发射一束光。比色皿只吸收特定波长的光，这种波长取决于溶液的浓度。未被吸收的光穿过样品，然后通过小孔传输，最终被光致发光探测器接收和记录，产生每种化合物都不同的特定光谱图谱。
除了在生物和化学研究中使用，紫外-可见光谱法还有多种实际应用。例如，它可以用于辨别艺术品的时期、制作某些颜色的材料，甚至在绘画修复中进行颜色识别。
这种非侵入性的光谱技术可以用于绘画和纺织品上颜料的鉴定，是其独特的特征之一。
此外，环境科学家使用分光光度计来模拟水中有机污染物的光化学转化，并研究地球上的空气质量和气候。
在更大的尺度上，天体物理学家使用UV-Vis来了解不同行星的大气层，例如火星和金星。
探索光的工具 : 紫外可见分光光度计之历史
1930 年代，维生素研究发现多种维生素，特别是维生素 A，可以吸收紫外线 (UV)。美国政府对使用紫外线和可见光 (UV-Vis) 光测量士兵口粮中维生素含量的兴趣推动了这项研究，并最终在 1940 年代初期进行了 UV-Vis 分光光度计的商业发布。
其中，贝克曼 DU 分光光度计于 1941 年首次销售，它通过提供更准确的结果并将分析时间从数小时甚至数周缩短到几分钟，从竞争产品中脱颖而出。
现代紫外-可见分光光度计与第一代 DU 有很大不同，但它们都基于相同的基本原理运行。光强度是在 UV-Vis 光源灯测量的光通过样品之前和之后测量。吸收的光量对应于样品中的分子浓度。无论是作为独立仪器还是高效液相色谱 (HPLC) 检测器，紫外-可见分光光度计都是测量分析物浓度不可或缺的。它们在科学研究、学术教学和 QA/QC 实验室研究药物、蛋白质、DNA、太阳能电池板、半导体和涂料等方面都扮演着重要角色。
新的仪器设计和附件扩大了紫外-可见样品的范围——从传统上在 1 厘米比色皿中以毫升体积测量的液体到今天的微量体积。诺贝尔奖获得者布鲁斯·梅里菲尔德 (Bruce Merrifield) 将紫外-可见分光光度计称为“可能是有史以来为推动生物科学发展而开发的最重要的仪器”。
20世纪30年代
1935年，阿诺德·贝克曼创立了国家技术实验室，后来命名为贝克曼仪器公司。
20世纪40年代
介绍了第一批商用紫外-可见分光光度计。1940年，贝克曼和国家技术实验室的同事制造了他们的第一台实验室分光光度计。该项目的负责人霍华德·H·卡里后来成立了卡里仪器公司。
1941年，贝克曼推出了DU UV-Vis分光光度计，它比任何其他商业仪器都具有更高的分辨率和更低的紫外线杂散光。
1946年，霍华德·卡里、乔治·W·唐斯和威廉·C·米勒以应用物理公司的名义创立了卡里仪器公司。此前，霍华德·卡里是贝克曼仪器公司负责开发的副总裁。
1947年，应用物理公司向宾夕法尼亚州匹兹堡的梅隆研究所交付了第一台商用记录UV-Vis分光光度计Cary 11。
20世纪50年代
1950 年代 – 1970 年代 批量生产降低了紫外-可见分光光度计的成本。 新的光电二极管阵列同时收集所有波长，将扫描光谱所需的时间从几分钟缩短到几秒钟。 1950 年，National Technologies Laboratories 更名为 Beckman Instruments, Inc。
1953 年，Bausch & Lomb 推出了 SPECTRONIC 20 紫外-可见分光光度计，这是第一款批量生产的低成本紫外-可见分光光度计。
1954 年，Applied Physics Corporation 推出了 Cary 14 分光光度计，这是第一台商用双光束分光光度计。 双光束设计通过同时测量样品和溶剂在紫外、可见和近红外波长的宽光谱范围内的透射率，大大简化和加快了样品分析。
20世纪1960年代
1963 年，JASCO 推出了具有双光束紫外-可见功能的 ORD\UV-5。
1966 年，Applied Physics Corporation 被 Varian Medical Systems 收购，成为 Varian 的 Cary Instruments 部门。
1969 年，Cecil Instruments 推出了 CE 212，这是世界上第一款用于 HPLC 的商用可变波长检测器，用户无需更换滤光片或灯即可在单个检测器上选择检测波长。
20世纪70年代
1979 年，惠普推出了第一台商用二极管阵列分光光度计 8450A。 与一次扫描一个波长的单个光电倍增管的传统扫描分光光度计不同，8450A 利用光电二极管阵列在几秒钟内同时扫描整个波长光谱。
20世纪80年代
80 年代个人电脑的普及改进了数据采集和仪器控制。 1980 年，Bausch & Lomb 推出了 Spectronic 2000 紫外-可见分光光度计，这是第一台微处理器控制的双光束紫外-可见分光光度计。 现在，双光束设计不再像单光束分光光度计那样分别测量样品和溶剂的透过率，而是通过同时测量样品和溶剂的透过率，大大简化和加快了样品分析。
1987年，Pye Unicam Corporation。 推出 PU-8700 紫外-可见分光光度计，这是第一款鼠标驱动的图形界面紫外-可见分光光度计。
1989 年，现年 88 岁的 Arnold O. Beckman 博士因其在分析仪器开发方面的领导地位而获得国家科学奖章。
20世纪90年代
1990 年代，外部软件现在提供 PC 控制、屏幕光谱显示以及光谱再处理和存储。 光纤减小了仪器尺寸，光纤采样附件允许在紫外-可见分光光度计的样品室外进行样品测量，无需填充样品池和比色皿。
1995 年，Hewlett-Packard 推出了 8453A，这是第一款体积小、功能齐全的二极管阵列分光光度计。
1997 年，Beckman Instruments, Inc. 收购了血液和细胞分析系统的领先制造商 Coulter Corporation。 1998 年，公司更名为贝克曼库尔特公司。
1999 年，惠普宣布战略调整，创建一家独立的测量公司 Agilent Technologies。
2000年代
2000 年，在生物技术和制药应用中测量微量液体样品 (< 1 μL) 的能力取得了重大进展。 紫外-可见光谱应用于太阳能等替代能源研发。 仪器制造商开始将仪器小型化并开发用于特定应用的专用仪器，例如生物应用。
2000 年，Thermo Scientific 推出了具有平面外光学器件的 GENESYS 10 仪器，可最大限度地减少杂散光并降低仪器光学器件引起的噪声。
2002 年，Varian Inc. 发布了 6000i UV-Vis-NIR 分光光度计。 Cary 6000i 使用 InGaAs 检测器，与传统硫化铅检测器相比提高了信噪比。 其 175 nm 至 1800 nm 的工作范围适用于材料科学研究。
2003 年，Thermo Scientific 推出了 Evolution 300 分光光度计，这是第一款基于双光束氙灯的分光光度计。 双光束设计简化并加快了样品分析。 氙气闪光灯提供高能量光源，与传统的钨灯和氘灯相比，预热时间更短，灯寿命更长。
2004 年，Shimadzu 推出了 SolidSpec-3700/3700DUV 系列紫外-可见-近红外分光光度计，这是第一款具有三个检测器的紫外-可见-近红外分光光度计——一个用于紫外可见区域的光电倍增管，一个用于紫外-可见区域的 InGaAs 检测器和一个冷却的 PbS 检测器 近红外区域。
2005 年，仅用于 1 μl 样品微量定量的 NanoDrop ND-1000 紫外-可见分光光度计（来自 NanoDrop Technologies）进入市场。 样品被直接移到光纤测量表面上，在表面张力的作用下样品被固定在适当的位置，无需比色皿或毛细管。
2006年，JASCO生产了一系列新的紫外-可见-近红外分光光度计，并配有兼容的附件，用于生命科学，材料分析和半导体研发。
2008年，岛津推出UV- 1800紧凑型紫外可见分光光度计。它的占地面积比它所取代的UV-1700小15%。
同样在2008年，Perkin Elmer发布了LAMBDA Bio UV-Vis分光光度计，预配置了生物应用的标准方法，包括蛋白质测定，细胞密度测量，以及DNA, RNA和寡核苷酸浓度和纯度。
紫外-可见分光光度计的未来改进将侧重于易用性、便携性和特定应用仪器。 固体样品和材料的紫外-可见分析在太阳能电池研究、半导体产品和涂层材料等领域不断发展。 光源的进步将为传统分光光度计和手持式紫外-可见仪器带来新的发展。 远程传感器的进一步发展将使更多类型的样品能够在实验室外进行测量。
探索光的工具 : 紫外可见分光光度计之深入原理与应用
紫外-可见光谱法在许多领域中都具有重要的应用。在生物和自然科学研究中，UV-Vis被广泛应用于定量测量样品中的细胞和蛋白质浓度。
其中一个例子是使用UV-Vis测量细胞培养物的光密度（OD）。这种技术在微生物学中广泛用于表征培养基中的细菌浓度。除了这种经典技术之外，最近研究人员开始分析整个UV-Vis波长谱，即使在低浓度下也能提供更准确和可重复的生长速率测量（McBirney，2016）。
在生物研究中的另一种技术是使用UV-Vis进行蛋白质浓度定量。该技术在蛋白质表达分析期间广泛应用，以确保样品中的总蛋白质浓度差异不会干扰实验蛋白质表达结果。对于蛋白质定量，会制备几个稀释样品，以及一个已知浓度的对照样品。向稀释样品中加入等量的特殊试剂（例如Bradford试剂），会在样品中产生颜色变化。颜色的强度，取决于存在的蛋白质量，允许确定蛋白质浓度和吸光度。
紫外-可见光谱法在临床应用中有多个方面。其中一个领域是将紫外-可见光谱法应用于组织诊断。在医疗程序中，专业人员会取出病人的组织样本并送往实验室，以便寻找异常。这些诊断在许多医学领域非常重要，从肿瘤学到免疫学和病毒学都涉及到。荧光分析是一种常用于组织样本的技术，可以使临床医生了解他们研究的组织的细胞、基因和分子组成。通过激发荧光物质的激光器，这些荧光物质在肿瘤学、神经科学和干细胞研究中越来越受欢迎。这些荧光物质的激发波长范围从350到360nm，非常适用于紫外-可见光谱法。由于它们能被紫外-可见光谱法强烈激发，研究人员和临床医生可以获得非常清晰的组织图像，从而能够为患者提供更好的诊断。
紫外-可见光谱法还非常敏感于许多癌症生物标志物，通过样品中传递的光的吸收和散射可以用于检测肿瘤的细胞组织和结构。
在乳腺癌中，紫外-可见光谱法可以提供肿瘤环境的非侵入式快照，无需手术。例如，一项研究利用紫外-可见光谱法定量分析在小鼠上生长的癌瘤中的生物标志物。从紫外-可见光谱法获得的光学测量结果与传统的免疫组织化学染色方法进行了比较。两种方法都显示肿瘤缺氧水平的统计学变化相同，证明了紫外-可见光谱法在监测肿瘤缺氧方面的应用与其他方法相当。通过测量紫外-可见光谱法中的吸收和散射水平，还可以确定一份完整乳腺组织样本是否恶性。恶性乳腺组织比良性或正常组织吸收和散射更多的光。通过紫外-可见光谱法，β-胡萝卜素的浓度（常见于脂肪组织中）在正常组织中比良性或恶性肿瘤中更高。
UV-Vis光谱法可以通过活体组织中的光纤探针测量散射和吸收光线、血管直径以及血红蛋白和β-胡萝卜素的浓度来进行。
这些测量可以帮助将组织分类为恶性或正常的。有趣的是，一项研究使用UV-Vis光谱作为一种非侵入性诊断动脉粥样硬化（或称动脉硬化）的方法。两组兔子被同时饲喂两种不同的食物，其中一组被饲喂控制组的普通食物，另一组被饲喂富含胆固醇和橄榄油补充的实验性食物。使用UV-Vis分析兔子的血液，发现富含胆固醇的兔子的吸光度比普通食物的兔子高得多。如果将此方法应用于人类，UV-Vis光谱可能有助于非侵入性地检测动脉粥样硬化的进展）。
UV-Vis技术在许多化学应用中被广泛使用，其中最常见的是确定有机分子的结构。
该技术可以确定有机化合物中的不饱和度，即是否含有双键/三键，以及杂原子（除碳以外的原子）的存在。这个过程是如何工作的呢？紫外区域位于200nm-400nm之间，可见光区域位于400nm-800nm之间。有机分子形成两种键：sigma（单）键和pi（双/三）键。sigma键中的电子结合紧密，因此当被UV-Vis辐射激发时无法跃迁到更高的能级。这些电子不会吸收UV辐射。形成pi键的电子，然而结合较松散，可以很容易地被激发到更高的能级。共轭体系可以使pi电子离域，降低所需的UV-Vis能量，使电子更容易被激发到更高的能级。因此，如果一个化合物不吸收UV辐射，意味着其结构中没有pi键或共轭体系。
酶是催化底物转化为一个或多个产物的蛋白质。酶活性的速率可以通过测量底物浓度的减少或产物浓度的增加随时间的变化来计算 。
由于底物和产物在化学和结构上有所不同，它们在吸收率上也有所不同。因此，可以通过记录底物和产物的吸收率随时间的变化来跟踪酶催化反应的进展。由于吸收率的变化与浓度的变化成正比，只要底物的吸收系数已知，就可以使用吸收数据确定反应的速率。使用NADH作为辅因子的酶催化反应（例如参与细胞呼吸的反应）是吸收率基础酶测定的例子。NADH（还原形式）在约340 nm处有一个吸收峰，而NAD+（氧化形式）在电磁光谱的紫外-可见区域内没有吸收。因此，可以通过随时间跟踪340 nm处的峰的下降来直接测量脱氢酶等酶的活性。
紫外-可见光谱技术对环境健康和污染治理有着重要的影响。
农业径流和工业废水负面影响了水生态系统中的水质。由于该技术的精度、效率、非侵入性采样特性和便携性，许多研究人员利用UV-Vis进行水质测试。水中常见的污染物可以吸收特定波长的光（。例如，硝酸盐（NO3）的特征光谱是223-260 nm，氧气是260-320 nm，浑浊度的指标返回320-700 nm的测量值。通过利用UV-Vis，水质可以在全球范围内快速、高效地监测。
UV-Vis在废水管理中的一个应用示例是检测溶解有机碳（DOC）。DOC是碳循环的常见产物，但如果不仔细监测，仍会对人类健康产生负面影响。这使得研究DOC对水质评估和废水管理非常重要。在一项监测热带泥炭地的研究中，发现可以通过单波长和双波长UV-Vis技术精确地研究热带水域中的DOC。
紫外线分光光度计的工作原理是什么？
要准确地使用紫外线分光光度计进行分析，需要正确准备样品并正确放置在仪器中。
从样品制备开始，常用的方法是连续稀释法。连续稀释用于两个目的：
1.允许有足够的体积填充比色皿和
2.创建可以被仪器准确分析的样品。
它有助于分析的准确性，因为高浓度样品需要强烈的光源提供可检测的透过率，因此创建一个浓度较低的样品允许入射光足够强度以进行可检测的透过和吸收。
具体来说，进行连续稀释取决于所需的稀释倍数。如果需要1：100的稀释倍数，需要将1单位的浓缩样品放入一个试管中，然后加入99单位的稀释剂。这个新样品可以用于另一个1：100的稀释，将1单位的新样品和99单位的稀释剂在另一个试管中混合，得到1：10,000的稀释倍数。计算最终稀释倍数的方法是使用公式：最终稀释倍数= DF1 x DF2 x DF3 …等等
使用分光光度计时，通过最小化光散射或不准确的吸收来减少误差。空白校正是一种方法，其中溶剂或任何不需要的试剂被用作0吸收参考，以确保其不会干扰样品的吸收。确保比色皿不脏或损坏可以避免一些光散射。脏或损坏的比色皿会导致在320 nm处吸收，这不应视为正在分析的样品的吸收范围。
紫外分光光度计利用了控制光吸收的基本定律——Beer定律。
Beer定律的表达式如下：
其中， 代表样品的吸光度， 代表吸收物种的摩尔消光系数， 代表光束通过样品的路程长度，而代表吸收物种的浓度。光和物质的相互作用非常有趣，由于能量是量子化的，只有能量与分子内电子转移匹配的光才会被吸收。当分子吸收这种能量时，特定的电子被提升到激发态，电子随后返回其基态并以光或热的形式释放能量。因此，这个过程中释放的光的能量比激发电子所用的光的能量低，因此波长更长。
在紫外分光光度计中，紫外光的波长被照射到样品上。机器记录吸收的光的波长和每个波长被吸收的程度。最终的光谱呈现了吸光度与波长的图表；回顾Beer定律，吸光度可用于定量测量溶液中的样品浓度。
紫外光谱分析
完成紫外可见光谱分析后，结果呈现为具有波峰和波谷的周期函数图。这样的图形是通过用一系列波长的辐射处理样品得到的。机器检测器专门识别吸收的波长及其吸收程度。图形可以有一个峰值或几十个峰值，这取决于样品的分子结构。
生成图形后，可以使用几个不同浓度的样品复制几次，以创建一个校准曲线，该曲线将吸收的光量（吸光度）绘制成溶液浓度的函数，以查看随着溶液变得更浓或更稀时吸光度的变化程度。这在确切浓度未知的样品中非常重要，例如分析反应中某些物种的降解情况的实验。在比较一组样品时，常常将值叠加并进行标准化处理。标准化处理需要将曲线内的所有值除以峰值吸光度，使最高吸光度归一化为1，从而更容易通过使用百分比计算峰值的相对变化。尺寸较小的峰被认为是“蓝移”，而较长波长的峰被认为是“红移”，这是因为在可见光谱中蓝色和红色的相对大小。
其中一个关键的特性是波长最大值。波长最大值是样品观察到最大量光的波长。在这一点上，值得注意的是吸光度 。传统上，仪器本身能够通过将样品通过前的光强除以样品通过后的光强并取该商的自然对数来计算吸光度。
UV-Vis是一种非常有用的技术，具有许多独特的应用；然而，仪器分析揭示了一些局限性。UV/vis光谱需要纯净的样品才能最准确地确定样品的吸收谱。然而，如果将具有多个可检测化合物的样品放入仪器中，则校准以检测一种化合物的存在最终将导致其他化合物吸收类似的波长。这会在峰值中产生噪声，提高定量限，并在足够高的量下使读数毫无意义。
在利用UV/vis光谱结果时另一个需要考虑的问题是选择用于样品的辐射源或探测器。在尝试识别分析物时，了解要查找的光的波长是至关重要的，因为不同的辐射源产生不同的发射范围。
因此，选择正确的探测器会影响产生结果的灵敏度。例如，氘灯产生185-400 nm的发射范围，而氙弧灯产生270-1000 nm的发射范围。
最后，紫外/可见光谱的一个关键是该技术可以更好地识别某些分析物。例如，吸收可见光的材料（如紫水晶、红宝石、祖母绿和颜料）非常适合通过UV/Vis光谱进行识别。然而，其他物质，如透明的钻石、石英、玻璃和一些金属，则难以仅通过UV/vis光谱来识别。因此，应该将UV光谱与其他形式的光谱学，如质谱和红外光谱结合使用，以完全表征化合物。通过利用多种光谱技术，可以增加实验结果的检测和定量限的下降，提高实验结果的准确性。
